紐約自然歷史博物館的夜班保安拉裏(本•斯蒂勒飾)在趕跑了妄圖監守自盜的三個瘋狂老同事，拯救了一到晚上就撒歡吵鬧的博物館藏品之後，總算過上了兩天不用操心的舒服日子，不光兒子把他視為英雄，愛情翩翩降臨，工作也升級為光鮮的發明公司CEO。可是好景不長，博物館關門整修，藏品給挪到了華盛頓的史密森博物館繼續展出。　　
　　拉裏知道後，急忙趕到博物館。企圖阻止將藏品轉移，但是除過羅斯福的蠟像，所有藏品都要被史密森博物館永久封存。但是用來喚醒藏品的牌匾卻依舊停留在自然歷史博物館。但他沒有想到的是，猴子偷了牌匾。邪惡的法老王卡門拉（漢克-阿紮利亞飾）利用拿破崙、伊凡雷帝和阿爾•卡邦等人，企圖利用牌匾的威力喚醒卡門拉的地下軍，統治世界。。。。
　　拉裏雖然得到了第一個駕機飛越大西洋的女豪傑艾米莉婭•埃爾哈特(艾美•亞當斯飾)的幫助，甚至就連林肯雕像都放下身段，力促雙方和解，可無奈史密森博物館裏都是狠角色，不光是巨大的恐龍化石，猛獁象，甚至上世紀二三十年代的黑幫大亨阿爾•卡邦，星球大戰中的黑武士也來橫插一腳。而拉裏越幫越忙，陷入了自劇照身難保的悲慘境地。至於他的老朋友和新朋友 還有那個企圖心很大的法老，會發生怎樣的故事呢？
　　私生活亂得一團糟的拉裏.戴利，自從在不久前好不容易拿到的那份博物館夜間看守工作中發生了一些神奇的事件之後，拉裏的整個人生都改變了。不過這個秘密他是一直打算保護下去，不告訴任何人，一是他害怕被人當成精神病關起來；二則是他認為自己的這段奇遇是獨一無二的，並沒有什麼必要和其他人分享。在一群史前怪物和歷史名人的幫助下，拉裏的工作做得有聲有色，頗受博物館領導的讚賞，不過他要暫時和紐約自然歷史博物館說再見了，因為拉裏已經準備安安心心的搞自己的發明公司，對這份管理員職務說拜拜啦！
　　同時，紐約自然歷史博物館要擴大規模，在改建期間，一些珍貴的歷史藏品就必須得運往其他博物館進行保管，而大部分藏品都運往了史密森尼博物館。要知道，這個博物館可是全球最大的自然歷史博物館，裏面有超過上億件藝術藏品和珍貴的標本。拉裏得知了這個消息，知道那些閒不住的展品們肯定要把新家鬧得雞犬不寧，於是試圖阻止博物館的這一舉動，但在館長的堅持之下，要運走的展品，還是轟轟烈烈的上路了，而在其中，猴子代克斯將一塊描述古希臘英雄阿伽門農的牌匾也偷偷的拿上了車……